Характеристика деградации фибронектина под действием тромболитических препаратов

Для восстановления проходимости артерий и вен при ра­зличных заболеваниях, в том числе и инфаркте миокарда, при­меняют препараты, которые способствуют растворению тромба и противодействуют аггрегации тромбоцитов. Наиболее эффек­тивными являются препараты тромболитического действия, ко­торые гидролизуют фибрин в составе тромба (фибринолизин или плазмин), либо активируют эндогенный фибринолиз (стрептокиназа, урокиназа). Известно, что в формировании тромба участвует фибронектин (ФН) – полифункциональный гликоп-ротеин плазмы крови и экстрацеллюлярного матрикса. Взаимо­действие ФН с фибрином приводит к увеличению его способ­ности связывать тромбоциты и усиливает стабильность тромба. Молекула ФН содержит участки, чувствительные к дей­ствию протеолитических ферментов, под действием которых образуются фрагменты ФН (фФН), функции которых отлича­ются от таковых нативного ФН. В наших предыдущих исследо­ваниях было показано, что фрагментированность ФН плазмы крови больных острым инфарктом миокарда повышается в условиях применения тромболитической терапии [2]. Однако, динамика деградации ФН под действием этих препаратов и об­разования функционально активных фФН не исследовалась. Между тем, получение таких данных может быть полезным в оценке эффективности и безопасности тромболитической тера­пии.

Целью нашей работы было исследование степени дегра­дации ФН под действием плазминогена и стрептокиназы в условиях in vitro.

В работе использовали очищенный препарат ФН (Sigma, США), плазминоген (ПГ), полученный в лаборатории отдела химии и биохимии ферментов Института биохимии им. О.В. Палладина, и стрептокиназу (Фармакиназа, Bharat Serums and Vaccines Limited In., Индия). Исследование фФН проводили методом вестерн-блот анализа с использованием специфичес­ких антител к ФН, полученных в нашей лаборатории. Деграда­цию ФН осуществляли путем его инкубации с плазмином в 0,1М забуференном физиологическом растворе (ЗФР) рН 7,4 при 370С в течение 1, 30 и 90 мин. Для контроля проводили анало­гичную обработку ФН плазминогеном и стрептокиназой в со­отношениях, соответствующих физиологической норме или ре-комендованых фирмой-производителем. По окончанию инку­бации образцы подвергали тепловой обработке при 100 0С в течение 90 секунд в буфере Лэммли. При этом одновременно останавливалась ферментативная реакция за счёт тепловой де­натурации.

Результаты исследования и их обсуждение

Как и следовало ожидать, обработка ФН активирован­ным под действием стрептокиназы плазминогеном приводила к существенным изменениям в спектре фФН. Так, через 1 мин инкубации смеси ФН-плазминоген-стрептокиназа определялся фрагмент с молекулярной массой 68 кДа, увеличение времени инкубации до 30 мин приводило к появлению ещё двух поли­пептидов с молекулярной массой 72 и 62 кДа, а после 90 мин инкубации определялись ещё 4 новых фФН с молекулярной массой от 92 до 34 кДа. Инкубация ФН с плазминогеном не вызывала изменений в спектре фФН в течение первых 30 мин и лишь после 90-минутной обработки появлялись два новых полипептида с молекулярной массой 72 и 68 кДа. Другая кар­тина наблюдалась при инкубации ФН со стрептокиназой: уже через 1 мин инкубации появлялся фФН 68 кДа, а дальнейшее увеличение времени инкубации не приводило к изменению спектра фФН.

В наших предыдущих исследованиях мы показали, что фФН 68 и 72 кДа могут быть результатом действия других про-теиназ: трипсина, химотрипсина и коллагеназы. Можно пред­положить, что появление указанных выше фФН под действием плазминогена и стрептокиназы связано с собственной катали­тической активностью молекулы ФН. Есть также сведения, что взаимодействие плазминогена с фибронектином приводит к его активации, однако, результаты наших исследований не под­твердили этого.

Анализ спектра фФН, образовавшихся под влиянием плазминогена, активированного стрептокиназой показал, что с увеличением времени инкубации до 90 мин, согласно инструк­ции производителя препарата стрептокиназы, увеличивается степень деградации ФН и появляются фФН с Мм 92, 56, 36 и 34кДа. В наших предыдущих исследованиях было показано, что степень фрагментированности ФН закономерно изменяется у больных с острым инфарктом миокарда в течение госпиталь­ного периода и коррелирует с типом его осложнений. Так, к моменту окончания тромболитической терапии количество фФН 92кДа резко повышалось. Увеличение количества вы­ше упомянутых фрагментов в сыворотке крови свидетельствует о повышенной активности плазмина и может использоваться как предиктор возможных геморрагических осложнений при тромболизисной терапии.

Авторы: Кулинич А.А., Пелешенко А.Б., Скоромная А.С., Шевцова А.И., Островцова С.А.

ГУ «Днепропетровская медицинская академия Министерства Охраны Здоровья Украины»

Leave a Comment

Your email address will not be published. Required fields are marked *